Морфометрическая оценка изменений седалищного нерва крысы в контроле и при введении местных анестетиков в эксперименте

Недзвецкий С.В., Куренков Е.Л., Тарасов А.Н.

Челябинская государственная медицинская академия, кафедра нормальной анатомии (зав. кафедрой профессор Куренков Е.Л.), кафедра госпитальной хирургии, реаниматологии и интенсивной терапии (зав. кафедрой профессор Андриевских И.А)

Актуальность. Вопросы нейротоксичности местных анестетиков в настоящее время остаются открытыми и недостаточно изучены. По данным разных авторов транзиторные неврологическии нарушения, развивающиеся после регионарной анестезии, составляют от 0,4 до 35% в зависимости от вида местного анестетика. В большинстве случаев данные нарушения носят преходящий характер. Тем не менее, имеются данные о развитие серьезных неврологических нарушений в виде синдрома «конского хвоста», после спинномозговой и эпидуральной анестезии [6].

Цель работы. Изучение морфологических изменений седалищного нерва крысы в эксперименте и морфометрическая оценка повреждения нервной ткани.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены в центральной научно-исследовательской лабораторииЧелГМА с соблюдением правил использования и содержания лабораторных животных (приказ № 755 МЗ СССР от 12.07.1977 г.), норм асептики и антисептики. Проведено 2 серии экспериментов на 42 беспородных, половозрелых крысах-самцах массой 150-200 г. Первой группе животных субневрально вводили местный анестетик Наропин 0,3 мл 0,22 мг. (n=10), второй 0.3 мл маркаин 0,15 мг (n=10), в третьей – предложенную нами оригинальную смесь 0,3мл лидокаин и маркаин 0,03мг и 0.05 мг соответственно алкалинизированная 3% раствором гидрокарбонатом натрия в объеме 0,1 мл.(n=10). Контролем служили две группы животных, которым вводили изотонический раствор натрия хлорида (n=6) и 96% спирт (n=6) в идентичном объеме. Животных выводили из эксперимента в два этапа - на 1-е и 7-е сутки после введения анестетиков и в контроле (по 21 особи на каждом сроке). Для умерщвления крыс использовали передозировку эфирного наркоза.

Иссеченные участки седалищного нерва длиной 15-20 мм фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Далее кусочки нерва обезвоживали, обезжиривали и подвергали заливке в парафин. Серийные, плоскопараллельные тканевые срезы в количестве 3-6 , толщиной 5-7 мкМ помещали на предметных стеклах. Затем гистологическии срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике [9, 11].

Для идентификации миелиновых оболочек по Шпильмейеру отрезки нерва подвергались фиксации в 10% формалине в течение 5 суток, после чего из них готовили замороженные срезы, которые окрашивались гематоксилином Гейденгайна. Миелин в составе нервного волокна окрашивался в черный цвет. Объемное содержание миелиновых волокон, зон демиелинизации определяли методом точечного счета с использованием окулярных сеток [2].

Подсчитывали не менее 1000 точек при увеличении ×400 на 5-10 случайно отобранных полях зрения для каждого наблюдения. Количество нейролеммоцитов подсчитывали в единице площади равной 0,003 мм2 при увеличении ×1000.Толщину миелиновых волокон определяли при помощи лицензионной программы анализа изображения микрообъектов «MoticImages Plus 2».

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью лицензионного пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft, Inc.»). Применялись методы вариационной статистики: определение средней арифметической, среднее квадратическое отклонение, стандартной ошибки средней арифметической. Статистическая значимость различий сравниваемых количественных признаков проводилась с помощью непараметрического U-теста Манна-Уитни. Качественные признаки оценивали с применением точного критерия Фишера [12]. Различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05, что соответствует 95% вероятности безошибочного прогноза.

Результаты и обсуждение. Во всех группах крыс, которым вводились анестетики, структура нервного ствола оставалась сохраненной. Содержание миелиновых волокон в 1-е и 7-е сутки было меньшим при анестезии наропином по сравнению с контрольной группой (p<0,05) (рис. 9).

Вместе с тем, объемная плотность демиелинизированных зон мякотного волокна на любом сроке увеличивалась только у животных, которым инъецировали спирт (рис. 4.10).

Толщина миелиновых волокон в 1-е и 7-е сутки статистически значимо меньше после анестезии, чем при введении спирта. Статистически значимые различия обнаружены между контрольной группой и животными, подвергшихся анестезии наропином (9,0±0,2 мкм и 9,9±0,1 мкм в 1-е сутки и 8,9±0,1 мкм и 9,8±0,1 мкм соответственно; р<0,05) (рис. 11).

Наименьшее количество нейролеммоцитов в единице площади эндоневрального пространства обнаружено в 1-е сутки после введения спирта (p<0,05). На 7-е сутки достоверных различий в содержании шванновских между группами контроля и животными, которым вводился анестетик не получено (рис. 12). 

Таким образом, результаты нашего исследования согласуются основными патогенетическими механизмами воздействия инъекционных препаратов на периферические нервы. Среди них называют сдавление нервных волокон введенным раствором, ишемию нерва в результате химического повреждения сосудов, питающих нерв и нейротоксичность [5]. При этом считается, что повреждение нервно-тканевого барьера зависит от проникающей способности и экспозиции влияющего фактора [13].

Данные комплексного морфологического изучения показали, что альтеративные процессы в седалищном нерве присутствовали при субневральном введении использованных нами видов растворов. Их проявлением в 1-е сутки после воздействия стали отек стромы нерва, набухание миелиновых оболочек с увеличением диаметра, следовательно, объемной доли мякотных волокон, что согласуется с литературными данными [10, 14]. К 7-м суткам нарастание повреждения миелоархитектоники нерва и развитие экссудативной фазы воспаления имелось только в группе крыс, которым вводили спирт. Картина наблюдаемой нами уоллеровской дегенерации миелиновых волокон периферического нерва согласно литературным данным сохраняется до 14-16 дней после воздействия [1, 16]. В контрольной группе и у животных при введении анестетиков, смеси восстановление структуры нервного ствола происходило к концу первой недели. Отек, появление скудной лейкоцитарной инфильтрации эндоневрия на 7-е сутки после анестезии наропином, вероятно, обусловлены его физико-химическими свойствами, а именно, плохой растворимостью в воде [15]. Возможно, это приводит к более низкой утилизации (всасываемости) препарата в зоне инъекции по сравнению с маркаином и физиологическим раствором. Во всех группах к 7-м суткам наряду с увеличением зон демиелинизации нарастало количество шванновских клеток. Это свидетельствует о репаративных процессах в нервных волокнах, обусловленных пролиферацией клеток-сателлитов нейронов [4, 8, 17].

Полученные нами морфометрические результаты демонстрируют отсутствие значительных различий при использовании в качестве анестетика предложенной смеси по сравнению с контрольной группой. Помимо кратковременности и слабой выраженности повреждения нервной ткани при ее применении морфофункциональное восстановление нерва происходило в короткие сроки, что, вероятно обусловлено влиянием компонентов смеси.

Литература.

1. Абдуллаев М.-С., Изменения миелоархитектоники нервов человека в условиях хронической ишемии / М.-С. Абдуллаев // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1988. – Т. XCIV. - № 4. – С. 86-95.

2. Автандилов Г.Г., Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. - М.: Медицина, 1990. – 383 с.

3. Акоев Г.Н., Регенерация седалищного нерва кролика после перерезки и применения различных хирургических методов / Г.Н. Акоев, Г.С. Кокин, Е.И. Чумасов и др. // Вопросы нейрохирургии. – 1988. - № 6. – С. 32-37.

4. Архипова С.С., Клетки-сателлиты спинального ганглия крысы после имплантации эмбриональной нервной ткани в разрыв седалищного нерва / С.С. Архипова, И.С. Рагинов, Г.А. Фомина и др. // Морфологические ведомости. – 2007. - № 3-4. – С. 8-12.

5. Берснев В.П., Постинъекционные повреждения периферических нервов / В.П. Берснев, А.В. Бабин, Е.И. Чумасов, К.М. Светикова // Вопросы нейрохирургии. – 1991. - № 1. – С. 25-27.

6. Волчков.В.А. Болевые синдромы в анестезиологии и реаниматологии/ Волчков.В.А., Игнатов.Ю.Д., Страшнов.В.И.// М.; МЕДпресс-информ,2006.-320 с.

7. Евтушенко В.П., Клинико-морфологическая характеристика хронического эндоцервицита: дис. … канд. мед. наук / В.П. Евтушенко. - Челябинск. – 2003. – С. 46. 

8. Жук О.Н., Влияние фактора роста нервов на регенерацию волокон в седалищном нерве крыс / О.Н. Жук, В.Н. Калюнов // Морфология. – Т. 110. - № 4. – С. 113-115. 

9. Лилли Р.Д., Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р.Д. Лилли. – М., 1969. – 645 с.

10. Мирошникова М.Е., Регенерация седалищного нерва крысы после его различных экспериментальных повреждений / М.Е. Мирошникова, Е.И. Чумасов // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1988. – Т. XCV. - № 1. – С. 30-35. 

11. Пирс Э., Гистохимия теоретическая и прикладная: Пер. с англ. / Э. Пирс. – М., 1962. – 962 с. 

12. Реброва О.Ю., Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTIKA / О.Ю. Реброва.- М.: Медиасфера, 2003. - 312 с.

13. Солнышкова Т.Г., Ультраструктурные изменения коры полушарий большого мозга при острой и подострой интоксикации природным сероводородсодержащим газом / Т.Г. Солнышкова, В.А. Шахламов // Арх. патологии. – 2003. – Т. 65. - № 2. – С. 17-20.

14. Солнышкова Т.Г., Патоморфологические изменения микроглии при хронической интоксикации сероводородсодержащим газом / Т.Г. Солнышкова, Ю.Г. Пархоменко // Арх. патологии. – 2003. – Т. 65. - № 3. – С. 41-44.

15. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. – М.: АстраФармСервис, 2004. – 1390 с. 

16. Чумасов Е.И., Регенерация нервов под влиянием бализа-2 и лактовита / Е.И. Чумасов., А.Я. Шурыгин, С.Ю. Солдатова и др. // Морфология. – 1993. – Т. 104. - № 5-6. – С. 25-33.

17. Ramer M., Functional regeneration of sensory axon into adult cord / M. Ramer, J. Priestley, S. McMahon // Nature. – 2000. – V. 403. – P. 312-316.